mRNA體外合成整體解決方案
mRNA（Messenger RNA），即信使RNA，是以DNA的一條鏈為模板轉(zhuǎn)錄而來(lái)，攜帶遺傳信息并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。mRNA疫苗是指將編碼抗原的mRNA引入體內(nèi)，利用宿主細(xì)胞自身的蛋白質(zhì)合成機(jī)制產(chǎn)生抗原蛋白，進(jìn)而觸發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。
新冠疫情在全球的肆虐，促進(jìn)了mRNA技術(shù)的發(fā)展，使其成為2021年《麻省理工科技評(píng)論》發(fā)布的“全球十大突破性技術(shù)”之首。也將疫苗的研發(fā)推上了新的高潮，全球的大型藥企均在抓緊時(shí)間布局新冠疫苗的研發(fā)。到目前為止，被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的疫苗類型主要包括：滅活疫苗、核酸疫苗、載體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和減毒活疫苗。而核酸疫苗中的mRNA疫苗在研發(fā)和生產(chǎn)等方面具備顯著優(yōu)勢(shì)，憑借其研發(fā)周期短、抗原選擇范圍廣；安全性高；有效性高、穩(wěn)定性好；生產(chǎn)難度低、速度快等優(yōu)勢(shì)，吸引了越來(lái)越多的企業(yè)進(jìn)入到mRNA疫苗的研發(fā)行列。mRNA技術(shù)經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展已日漸成熟，但要制備安全、高效、穩(wěn)定的mRNA疫苗，仍然存在一些難題，比如合成與純化足夠蛋白表達(dá)量的mRNA，mRNA在體內(nèi)的有效靶向遞送等。
mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)流程主要包括以下步驟：
1. 篩選分離目標(biāo)病原體；
2. 利用NGS技術(shù)進(jìn)行基因測(cè)序；
3. 篩選出對(duì)感染或復(fù)制重要的編碼目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列（或直接提取mRNA）構(gòu)建pDNA質(zhì)粒；
4. 體外轉(zhuǎn)錄：通常使用限制性核酸內(nèi)切酶線性化的pDNA質(zhì)粒作為模板，酶切位點(diǎn)選擇在質(zhì)粒3' 端的下游位置，隨后再次使用沉淀和提取純化線性DNA。轉(zhuǎn)錄過(guò)程還需要的一些酶包括：來(lái)自T7、T3或SP6噬菌體的RNA聚合酶、RNA酶抑制劑和無(wú)機(jī)焦磷酸酶（去除RNA合成過(guò)程中產(chǎn)生的的焦磷酸酯并競(jìng)爭(zhēng)性地抑制轉(zhuǎn)錄）。最后，使用RNase-free的DNA酶消化模板DNA。
5. 對(duì)mRNA進(jìn)行高度純化；
6. 制備mRNA無(wú)菌制劑；
7. 配送給需要接種的人群。
疫情當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外許多企業(yè)和機(jī)構(gòu)大量投入研發(fā)，建立mRNA疫苗新型研發(fā)平臺(tái)。作為國(guó)產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商，全式金為這些企業(yè)提供一系列相關(guān)產(chǎn)品，助力mRNA疫苗研發(fā)。
目標(biāo)抗原靶點(diǎn)篩選
1. TransStart? FastPfu Fly DNA Polymerase（AP231）
一種用于快速PCR的熱啟動(dòng)超高保真DNA聚合酶，該酶擴(kuò)增速度更快 (≤5 kb基因可實(shí)現(xiàn)12 kb/min的極速擴(kuò)增，＞5 kb基因可達(dá)到6 kb/min高速擴(kuò)增)，擴(kuò)增效率更高，產(chǎn)量更高，保真性更高，靈敏度更高。
· 保真性是EasyTaq? DNA Polymerase的108倍。
· 擴(kuò)增產(chǎn)物為平端，可直接克隆于pEASY?-Blunt 系列載體中。
· 基因組DNA 片段的擴(kuò)增 (≤ 15 kb)。
· Plasmid DNA片段擴(kuò)增 (≤ 20 kb)。
dNTPs是PCR的重要組成，它的質(zhì)量好壞嚴(yán)重影響PCR的保真性、特異性、擴(kuò)增效率。High Pure dNTPs（AD101）是美國(guó)進(jìn)口，市場(chǎng)上純度較高的dNTPs，純度在99%以上，不含DNase和RNase。
質(zhì)粒及模板制備
1. EasyPure? 1-Tube Universal EndoFree Plasmid MaxiPrep Kit (for 100-500 ml)（EM152）
利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNA，可實(shí)現(xiàn)100-500 ml LB培養(yǎng)基制備的大腸桿菌菌體的一管式裂解中和，上清液體積小于50 ml。溶液含指示劑，通過(guò)溶液顏色的變化，指示裂解、中和是否完全，實(shí)現(xiàn)操作的可視化。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA適用于酶切、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序和轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)。
2. EasyPure? 1-Tube Universal EndoFree Plasmid MaxiPrep Kit (for 100-500 ml)（EM153）
利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNA，可實(shí)現(xiàn)100-500 ml LB培養(yǎng)基制備的大腸桿菌菌體的一管式裂解中和，上清液體積小于50 ml。溶液含指示劑，通過(guò)溶液顏色的變化，指示裂解、中和是否完全，實(shí)現(xiàn)操作的可視化。全新內(nèi)毒素去除方案可使內(nèi)毒素水平低至0.001 EU/μg，使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA適用于酶切、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序和轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)。
3. FlyCut? 系列內(nèi)切酶
FlyCut? 系列5分鐘快速內(nèi)切酶，配有通用的專利性配方的特殊緩沖液，具有省時(shí)、高效（酶切效率高，無(wú)星號(hào)活性）的特點(diǎn)。
4. Phi29 DNA Polymerase（LP101）
由重組φ29 DNA polymerase 基因的載體，在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化而成, 分子量為74.4 kDa。具有高保真、高效率、高靈敏度、高產(chǎn)量的特點(diǎn)，用于測(cè)序、SNP基因分型、STR/微衛(wèi)星分析、病毒檢測(cè)和miRNA檢測(cè)。
體外轉(zhuǎn)錄
1. T7 High Efficiency Transcription Kit（JT101）
利用T7 RNA Polymerase，以含有T7啟動(dòng)子的超螺旋質(zhì)粒DNA或線性DNA為模板，對(duì)T7啟動(dòng)子下游的DNA序列進(jìn)行高效轉(zhuǎn)錄。適用于制備長(zhǎng)度超過(guò)6000 nt的高濃度RNA，制備的RNA可用于體外翻譯、RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)、RNA剪切以及雜交探針標(biāo)記等。全式金T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄試劑盒在每20 μl體系中，1 μg模板可以生成150-280 μg的RNA。
2. Ribonuclease Inhibitor Pro（AI201）
在mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程需要保持mRNA的穩(wěn)定性以保證疫苗高質(zhì)量生產(chǎn)。全式金RNase抑制劑酶Ribonuclease Inhibitor Pro是經(jīng)大腸桿菌表達(dá)、純化的豬源重組蛋白，特異性地抑制RNase A、RNase B和RNase C，活性高能夠顯著穩(wěn)定mRNA的存在。
3. DNase I (RNase-free ) （GD201）
在mRNA疫苗生產(chǎn)的過(guò)程中對(duì)DNA的殘留控制非常嚴(yán)格，全式金DNase I (RNase-free )能夠隨機(jī)分解DNA單/雙鏈，酶活性高，性能優(yōu)。
mRNA修飾
本產(chǎn)品包含牛痘病毒加帽酶、mRNA帽結(jié)構(gòu)2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和其他加帽反應(yīng)組分，可用于對(duì)T7體外轉(zhuǎn)錄（JT101）產(chǎn)生的RNA進(jìn)行5’加帽修飾，具有高效、高靈活性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。反應(yīng)產(chǎn)物為Cap1-mRNA，加帽效率可接近100%，并且帽子結(jié)構(gòu)方向正確，對(duì)于mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)（出核）、翻譯過(guò)程均有重要作用。
2. mRNA Poly(A) Tailing Kit（LA201）
本產(chǎn)品反應(yīng)時(shí)不依賴模板的存在，催化ATP轉(zhuǎn)化為AMP并依次摻入到RNA的3′ 末端，即在mRNA的3' 端加Poly(A) 尾，提高RNA在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。本產(chǎn)品具有很高的加尾效率，且可平行放大體系用于在體外轉(zhuǎn)錄（JT101）及加帽后（LC101）mRNA 的加尾修飾，制備可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的RNA樣品。具有高效率、高靈活性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。
樣品純化
DNA純化
1. MagicPure? Size Selection DNA Beads（EC401）
基于Solid Phase Reverse Immobilization (SPRI) 原理，采用具有獨(dú)特分離作用的磁珠與緩沖液系統(tǒng)，適用于DNA純化、DNA濃縮、高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建中DNA片段分選，使用方法可與主流文庫(kù)構(gòu)建試劑盒兼容。
RNA純化
1. MagicPure? mRNA Kit (EC511)
偶聯(lián)了Oligo (dT)的磁珠與帶Poly(A)尾的mRNA特異結(jié)合，純化后的mRNA純度高，完整性好，得到的mRNA適用于RT-PCR、qRT-PCR、二代測(cè)序等。本試劑盒適用于磁棒式高通量核酸提取儀。
2. EasyPure? RNA Purification Kit (ER701)
利用硅膠膜離心柱特異地吸附RNA，純化經(jīng)DNase I處理的總RNA產(chǎn)物、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、RNA標(biāo)記產(chǎn)物、合成RNA等，能有效地去除蛋白質(zhì)、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)鹽離子等雜質(zhì)，操作簡(jiǎn)便、快速。
3. MagicPure? RNA Beads (EC501)
利用獨(dú)特的磁珠與緩沖液系統(tǒng)，特異地吸附RNA，純化去除rRNA的RNA產(chǎn)物，經(jīng)DNase I處理的RNA產(chǎn)物，純化體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、RNA標(biāo)記產(chǎn)物和合成RNA等。操作簡(jiǎn)便、快速。
mRNA轉(zhuǎn)染
TransIntro? mRNA Transfection Reagent (FT501)
一款高性能的mRNA專用的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑，可直接將mRNA傳遞到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，避免了轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及進(jìn)入細(xì)胞核的限制，比常規(guī)DNA轉(zhuǎn)染方法效率更高。該試劑毒性低，轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)常規(guī)細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有比較好的效果，且不受血清和抗生素的影響，性能穩(wěn)定。
基因測(cè)序
全式金擁有DNA文庫(kù)構(gòu)建、RNA文庫(kù)構(gòu)建、rRNA去除試劑盒、mRNA捕獲試劑盒及文庫(kù)擴(kuò)增試劑盒等產(chǎn)品。
1. DNA文庫(kù)構(gòu)建（轉(zhuǎn)座酶法/傳統(tǒng)DNA建庫(kù)法/片段化酶法）
★TransNGS? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina? (for 50 ng/5 ng/1 ng DNA) (KP101/KP121/KP111)
★TransNGS? DNA Library Prep Kit for Illumina? (KP201)
★TransNGS? Fragmentase DNA Library Prep Kit for Illumina?(KP231)
★TransNGS? Fragmentase DNA Library Prep Kit for Illumina?(KP241)
2. RNA文庫(kù)構(gòu)建
★TransNGS? Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina?（KP701）
★TransNGS? Fast RNA-Seq Library Prep Kit for MGI?（KP801）
3. rRNA去除（人/小鼠/大鼠）
★TransNGS? rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (KD101)
4. mRNA磁珠捕獲
★MagicPure? mRNA Kit（EC511）
5. 文庫(kù)擴(kuò)增及qPCR精確定量
★TransNGS? Library Amplification SuperMix（KA101）
★TransNGS? Library Quantification Kit for Illumina?（KQ101）
自動(dòng)核酸提取儀
TS-32/96自動(dòng)核酸提取儀是采用先進(jìn)磁珠分離技術(shù)的高科技產(chǎn)品，具有自動(dòng)化程度高，提取速度快，結(jié)果穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。全式金作為國(guó)內(nèi)知名的核酸分離純化技術(shù)公司，可提供多種配套提取試劑盒，使儀器的使用范圍最大化，成本低廉化。
mRNA疫苗是一種通用的新型平臺(tái)技術(shù)，將來(lái)應(yīng)用前景十分廣泛，不僅僅是新冠等感染性疾病，還有望用于癌癥等諸多領(lǐng)域。針對(duì)mRNA疫苗研發(fā)生產(chǎn)，全式金擁有完整的mRNA體外合成產(chǎn)品線，能提供一系列體外合成酶及試劑，幫助各位客戶朋友們應(yīng)對(duì)研發(fā)過(guò)程中各項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)，助力開創(chuàng)疾病治療的“mRNA時(shí)代”。
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