NGS系列產(chǎn)品之表觀遺傳----ATAC和Cut&Tag
解鎖DNA-蛋白互作研究新技術(shù)，快來圍攻表觀遺傳的新秀
染色質(zhì)可及性
真核生物的核DNA并不是裸露的，而是有蛋白質(zhì)即組蛋白與之相結(jié)合。DNA一圈一圈地纏繞在組蛋白上，形成串珠式的結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)還能夠進(jìn)一步折疊、濃聚，并在其他架構(gòu)蛋白的輔助下，形成染色體。DNA的復(fù)制，基因的轉(zhuǎn)錄，需要將DNA的高級結(jié)構(gòu)解開。不需要將整個(gè)染色體全部打開，只需打開表達(dá)基因的區(qū)域。這一過程，主要由染色體的表觀修飾來實(shí)現(xiàn)。而這部分打開的染色質(zhì)，就叫開放染色質(zhì)（open chromatin）。染色質(zhì)一旦打開，就允許調(diào)控蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子）與之相結(jié)合。染色質(zhì)的這種特性，就叫做染色質(zhì)的可進(jìn)入性或可及性（chromatin accessibility）。
DNA折疊與開放示意圖
表觀遺傳學(xué)&研究方法
表觀遺傳學(xué)是一門研究基因表達(dá)調(diào)控的科學(xué)，它關(guān)注的是如何在不改變DNA序列的情況下，使基因表達(dá)受到行為、環(huán)境和表型的影響，可以說染色質(zhì)的可及性對于基因表達(dá)的影響非常關(guān)鍵。表觀遺傳學(xué)的研究背景主要是基于對基因表達(dá)調(diào)控的深入理解，以及探索環(huán)境因素如何影響基因的活性和表達(dá)。
表觀遺傳學(xué)的研究方法包括但不限于以下幾種：
1. ATAC-Seq技術(shù)：這是一種用于分析染色質(zhì)可及性的方法，可以揭示基因組中開放區(qū)域，這些區(qū)域通常是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點(diǎn)。
2. 全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)：這種方法可以檢測全基因組水平上的DNA甲基化狀態(tài)，是研究表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化的重要手段。
3. 簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)：這是一種針對基因組中富含CpG島區(qū)域的DNA甲基化分析方法，相對于WGBS，它成本較低。
4. 甲基化DNA免疫共沉淀測序(MeDIP-seq)：通過使用抗甲基化DNA的抗體富集甲基化DNA片段，然后進(jìn)行測序，以研究甲基化模式2。
5. 染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChIP-seq)：通過使用特定抗體富集與組蛋白修飾或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行測序，用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用。
6. CUT&Tag技術(shù)：這是一種較新的技術(shù)，用于在單細(xì)胞水平上研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用，相較于ChIP-seq，它更為簡便且適用于少量細(xì)胞樣本2。
7. 3C-seq技術(shù)：這是一種用于研究染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)，可以揭示基因組中不同區(qū)域的空間相互作用。
8. RNA測序(RNA-seq)：通過測序RNA分子來研究基因表達(dá)水平，是研究非編碼RNA和基因表達(dá)調(diào)控的重要方法。
這些方法的應(yīng)用和普及改變了人們對多種表觀遺傳現(xiàn)象的傳統(tǒng)認(rèn)識，使研究人員能夠更加全面地深入了解各種表觀遺傳標(biāo)志在機(jī)體內(nèi)的廣泛分布，以及它們?nèi)绾卧谕饨缫蛩氐挠绊懴掳l(fā)生相應(yīng)的動態(tài)變化。其中ATAC和Cut&Tag由于其靈敏度高，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，成為研究表觀遺傳學(xué)的利器。下面我們就這兩種方法來進(jìn)行詳細(xì)的介紹。
ATAC-Seq技術(shù)詳解
ATAC-Seq
ATAC（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是一種用于研究染色質(zhì)可及性的高通量測序技術(shù)。它的原理是：染色質(zhì)的開放區(qū)域更容易被轉(zhuǎn)錄因子和其他調(diào)控蛋白訪問，這些區(qū)域通常與基因的活躍表達(dá)相關(guān)。該方法通過Tn5轉(zhuǎn)座酶將序列接頭插入到染色質(zhì)開放區(qū)域，然后通過DNA測序數(shù)據(jù)分析來推斷染色質(zhì)各區(qū)域的基因活躍度情況。
ATAC-Seq的關(guān)鍵步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備：首先從細(xì)胞中提取染色質(zhì)，這是DNA和組蛋白緊密結(jié)合形成的物質(zhì)，它決定了基因的可訪問性。
2. 染色質(zhì)裂解：通過裂解細(xì)胞，釋放出染色質(zhì)，使其暴露出更多的表面區(qū)域。
3. 轉(zhuǎn)座酶處理：使用一種特殊的轉(zhuǎn)座酶Tn5，這種酶能夠識別開放的染色質(zhì)區(qū)域，并在這些區(qū)域切割DNA。
4. DNA片段化：轉(zhuǎn)座酶在開放染色質(zhì)區(qū)域切割DNA，產(chǎn)生小片段。
5. 測序接頭插入：轉(zhuǎn)座酶不僅切割DNA，還會在其切割位點(diǎn)插入測序所需的接頭序列。
6. 高通量測序：對這些切割并帶有接頭的DNA片段進(jìn)行高通量測序，以識別開放染色質(zhì)區(qū)域。
7. 數(shù)據(jù)分析：測序數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析，確定開放染色質(zhì)區(qū)域的位置，這些區(qū)域可能包含調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵元件。
ATAC實(shí)驗(yàn)原理示意圖
CUT&Tag技術(shù)詳解
CUT&Tag
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的技術(shù)，該技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶的特點(diǎn)，在切割染色質(zhì)的同時(shí)直接插入接頭（adaptor），極大地縮減了建庫時(shí)間，且對樣本量的要求更低，所需的測序深度也更低。
CUT&Tag的關(guān)鍵步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備：選擇或分離單細(xì)胞樣本，這對于研究細(xì)胞異質(zhì)性非常重要。
2. 抗體介導(dǎo)的富集：使用特定抗體識別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，這些蛋白可能是轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾或其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白。
3. Tn5酶切割：Protein A-Tn5酶復(fù)合體被引導(dǎo)至目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域，并在這些區(qū)域切割DNA。
4. 測序接頭添加：在切割位點(diǎn)添加測序所需的接頭序列。
5. PCR擴(kuò)增：由于單細(xì)胞樣本中DNA量較少，需要通過PCR擴(kuò)增來增加DNA片段的數(shù)量，以便進(jìn)行高通量測序。
6. 高通量測序：對擴(kuò)增后的DNA片段進(jìn)行高通量測序，識別目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域。
7. 數(shù)據(jù)分析：測序數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析，確定目標(biāo)蛋白在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能與基因調(diào)控密切相關(guān)。
Cut&Tag實(shí)驗(yàn)原理示意圖
ATAC PK CUT&Tag
ATAC-Seq和CUT&Tag是兩種用于研究染色質(zhì)狀態(tài)和蛋白質(zhì)-DNA相互作用的表觀遺傳學(xué)技術(shù)。它們在某些方面有相似之處，但也有明顯的區(qū)別。以下是對這兩種技術(shù)的詳細(xì)比較：
ATAC-Seq與CUT&Tag的聯(lián)系：
1. 轉(zhuǎn)座酶Tn5的使用：ATAC-Seq和CUT&Tag都利用了轉(zhuǎn)座酶Tn5的特性來切割染色質(zhì)。這種酶能夠識別開放的染色質(zhì)區(qū)域，并在這些區(qū)域切割DNA。
2. 染色質(zhì)開放性的分析：兩種技術(shù)都可以用于分析染色質(zhì)的開放性，即哪些區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子和其他調(diào)控蛋白可以訪問的。
3. 高通量測序：ATAC-Seq和CUT&Tag最終都涉及到對特定DNA片段進(jìn)行高通量測序，以獲得基因組范圍內(nèi)的信息。
4. 表觀遺傳學(xué)研究：它們都是表觀遺傳學(xué)研究的重要工具，有助于理解基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。
ATAC-Seq與CUT&Tag的區(qū)別：
ATAC-Seq | CUT&Tag | |
研究重點(diǎn) | 主要專注于分析染色質(zhì)的開放性，即哪些區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄因子和其他調(diào)控蛋白是可及的。 | 更側(cè)重于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用，可以提供更詳細(xì)的蛋白-染色質(zhì)相互作用信息。 |
樣本需求 | 通常需要較多的細(xì)胞樣本，適用于大量細(xì)胞的分析。 | 特別適用于少量細(xì)胞樣本，甚至可以在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析。 |
實(shí)驗(yàn)流程 | 操作相對簡單，主要涉及染色質(zhì)的裂解和轉(zhuǎn)座酶的切割。 | 需要使用特定抗體對蛋白進(jìn)行標(biāo)記，然后利用Tn5酶在抗體結(jié)合位點(diǎn)附近切割DNA。 |
技術(shù)靈敏度 | 適用于大規(guī)模的染色質(zhì)開放性分析，但對于低豐度蛋白質(zhì)的檢測可能不夠靈敏。 | 具有高靈敏度，能夠檢測低豐度蛋白質(zhì)的染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。 |
應(yīng)用范圍 | 廣泛應(yīng)用于研究啟動子、增強(qiáng)子和其他調(diào)控元件的開放性變化。 | 適用于研究組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄輔因子等，特別適合探究非典型DNA結(jié)構(gòu)。 |
數(shù)據(jù)解讀 | 數(shù)據(jù)解讀相對直觀，主要分析開放染色質(zhì)區(qū)域。 | 數(shù)據(jù)解讀可能更復(fù)雜，需要考慮蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合和相互作用。 |
結(jié)合使用這兩種技術(shù)可以提供更全面的表觀遺傳學(xué)信息。ATAC-Seq提供了染色質(zhì)開放性的全局視圖，而CUT&Tag則提供了特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的詳細(xì)信息。這種聯(lián)合方法使研究人員能夠同時(shí)研究染色質(zhì)的可及性和特定蛋白質(zhì)的結(jié)合模式，從而更深入地理解基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。通過理解ATAC-Seq和CUT&Tag的區(qū)別與聯(lián)系，研究人員可以根據(jù)具體的研究目的和樣本條件選擇合適的方法，或者將兩種技術(shù)聯(lián)合使用，以獲得更豐富的生物學(xué)信息。
經(jīng)過以上介紹，相信大家已經(jīng)對ATAC和Cut&Tag的研究方法以及它們之間的區(qū)別和聯(lián)系有了一定的了解，目前這2種技術(shù)也被廣泛的應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)的研究。全式金生物作為國產(chǎn)生物試劑原料供應(yīng)商，深耕分子生物學(xué)領(lǐng)域多年，始終堅(jiān)持自主創(chuàng)新，為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和服務(wù)。我們提供的ATAC-Seq、CUT&Tag建庫試劑盒，建庫效率高，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，助力表觀遺傳學(xué)研究。
ATAC-Seq
TransNGS? ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina?
產(chǎn)品特點(diǎn)
? 細(xì)胞數(shù)量少：所需細(xì)胞量少，50-50000細(xì)胞的起始量均可以獲得高分辨率的測序圖譜。
? 建庫時(shí)間短：5000及以下細(xì)胞時(shí)，建庫時(shí)間可縮短至2 h以內(nèi)。
? 文庫產(chǎn)量高：文庫質(zhì)量高，峰型好。
? 文庫峰型好：文庫峰型200-2000 bp，無明顯接頭峰。
? 無需分選：如對文庫長度分布無特殊要求，可以不用分選。
產(chǎn)品數(shù)據(jù)
產(chǎn)量高，峰型好
對不同細(xì)胞投入量（50-1,000 cells）的HeLa 細(xì)胞進(jìn)行ATAC 文庫構(gòu)建，不同細(xì)胞投入量的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)如下表。結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品可用于構(gòu)建低起始量（50 個(gè)細(xì)胞）的ATAC 文庫，文庫產(chǎn)量高，峰型好。
? 文庫產(chǎn)量
? 文庫峰型
? 與競品比較
分別使用TransGen 和Company V 產(chǎn)品對不同細(xì)胞投入量（5,000-50,000 cells）的HeLa 細(xì)胞進(jìn)行ATAC 文庫構(gòu)建。結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品的文庫產(chǎn)量、文庫峰型優(yōu)于競品。
? 文庫產(chǎn)量
? 文庫峰型
? 下機(jī)數(shù)據(jù)好
對不同細(xì)胞投入量（50-50,000 cells）的HeLa 細(xì)胞進(jìn)行ATAC 文庫構(gòu)建，將構(gòu)建后的文庫測序，下機(jī)后進(jìn)行生信分析。結(jié)果表明，IGV 視圖顯示ATAC 在關(guān)鍵位點(diǎn)與H3K4me3 基因的ChIP-seq 結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。
CUT&Tag
TransNGS? CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina?
產(chǎn)品特點(diǎn)
? 文庫產(chǎn)量高，峰型好
? 細(xì)胞投入范圍廣：適用于10-105 個(gè)哺乳動物細(xì)胞或經(jīng)過處理的細(xì)胞核，以及無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞（如植物細(xì)胞原生質(zhì)體等）建庫
? 操作時(shí)間短：約5.5 小時(shí)即可完成文庫構(gòu)建
? 測序質(zhì)量好：相同抗體孵育下，文庫的mapping 率更高，duplicates 率更低（尤其是在細(xì)胞投入量較少的時(shí)候）
? peak 位點(diǎn)準(zhǔn)確有效：與ATAC-seq 的peak 相比，陽性對照的peak 位點(diǎn)均真實(shí)有效
產(chǎn)品數(shù)據(jù)
不同細(xì)胞起始量建庫結(jié)果
使用TransGen 產(chǎn)品，分別對不同起始量的293T 細(xì)胞進(jìn)行CTCF 抗體的CUT&Tag 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品文庫產(chǎn)量高，不同細(xì)胞投入量下的文庫峰型和peak 位點(diǎn)基本保持一致，兼容低細(xì)胞投入量（10 cells）的文庫構(gòu)建。
? 文庫產(chǎn)量
? 文庫峰型
? Peak位點(diǎn)準(zhǔn)確有效
不同細(xì)胞核建庫結(jié)果
使用TransGen 產(chǎn)品，分別對293T 細(xì)胞核、擬南芥核進(jìn)行不同抗體的CUT&Tag 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，TransGen 產(chǎn)品建庫產(chǎn)量高，文庫峰型標(biāo)準(zhǔn)，適用于動物和植物細(xì)胞核的建庫。
? 文庫產(chǎn)量
? 文庫峰型
? 與競品比較
使用TransGen 和Company V 產(chǎn)品對不同起始量的293T 細(xì)胞進(jìn)行H3k4me3 抗體、CTCF 抗體和RNAPol II 抗體的CUT&Tag 實(shí)驗(yàn)，比較文庫產(chǎn)量，文庫峰型和測序結(jié)果。與Company V 相比，TransGen 產(chǎn)品文庫產(chǎn)量更高，文庫峰型更標(biāo)準(zhǔn)，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，兩者的peak 位點(diǎn)基本一致。
? 文庫產(chǎn)量
? 文庫峰型
? 測序數(shù)據(jù)
? Peak位點(diǎn)準(zhǔn)確有效
使用TransGen 產(chǎn)品，針對1×104 個(gè) 293T 細(xì)胞的不同靶蛋白（CTCF、H3k4me3、 RNAPol II）得到的CUT&Tag 文庫與293T 細(xì)胞的ATAC 文庫進(jìn)行peak 位點(diǎn)的比對，結(jié)果表明，各種CUT&Tag 文庫的peak 位置準(zhǔn)確。
使用TransGen 和Company V 產(chǎn)品，針對5×104 個(gè)293T 細(xì)胞的不同靶蛋白（CTCF、H3k4me3、 RNAPol II）得到的CUT&Tag 文庫，在2個(gè)不同染色體區(qū)段進(jìn)行peak位點(diǎn)展示，結(jié)果表明，TransGen 和Company V 的peak 位點(diǎn)基本一致。
不同靶蛋白的DNA 互作區(qū)域peak 對比圖
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產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 目錄號 | 規(guī)格 |
TransNGS? ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina? | KP171 | 12/96 rxns |
TransNGS? CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina? | KP172 | 12/96 rxns |
參考文獻(xiàn)：
DNA Packaging: Nucleosomes and Chromatin
